Thermo Scientific™ Pierce™ Cell Surface Biotinylation and Isolation Kit

Beschreibung

Merkmale des Kits zur Biotinylierung und Isolierung von Zelloberflächenproteinen:
• Verbesserte Leistung – Kit und Protokoll wurden neu entwickelt, um eine verbesserte Anreicherung und Extraktion von biotinylierten Plasmamembranproteinen zu erreichen und gleichzeitig eine intrazelluläre Proteinkontamination zu minieren.
• Optimiert – Das Protokoll wurde überarbeitet, um die Verarbeitungszeit und die Anzahl der Schritte zu reduzieren. Die Reagenzienformulierungen wurden für eine verbesserte Leistung optimiert.
• Kompatibel – Reagenzien wurden mit Suspensions- und adhärenten Zelllinien sowie unter Anwendung zusätzlicher Anweisungen für die MS-Probenvorbereitung verifiziert.
• Validierte Anwendungen – Reagenzien und Verfahren sind mit Western-Blotting- und MS-Anwendungen kompatibel

Dieses anwenderfreundliche Kit enthält alle erforderlichen Komponenten und Verfahren für eine optimale Markierung und anschließende Isolierung von Zelloberflächenproteinen. Puffer werden vorformuliert geliefert, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Säugetierzellen werden zuerst mit EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin markiert, einem thiol-spaltbarem, aminreaktivem Biotinylierungsreagenz. Anschließend werden die Zellen lysiert und die markierten Proteine werden mit NeutrAvidin Agarose eingefangen. Dithiothreitol (DTT) wird bei der Elution verwendet, um die Disulfid-Bindungen in der Biotinmarkierung zu reduzieren, was zur Freisetzung der gebundenen Proteine ohne die Biotinmarkierung führt. Dieses Kit enthält ausreichend Reagenzien für acht Experimente, bestehend aus zwei 85- bis 95%igen, konfluenten 15 cm-Schalen oder vier 75 cm²-Kolben.

Zelloberflächenproteine stellen eine wichtige Untergruppe zellulärer Proteine dar und spielen eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion, Zelladhäsion und beim Ionentransport. Diese Proteine weisen mehrere Transmembrandomänen auf, was die effiziente Extraktion und Isolierung dieser Proteine erschwert. Häufig führen der Einsatz aggressiver Detergenten und die Bedingungen, die für eine effiziente Extraktion erforderlich sind, zu einer Denaturierung und Kontamination von Plasmamembranproteinen nach der Isolierung. Daher verwendet dieses Kit alternativ membranundurchlässiges, aminreaktives Sulfo-NHS-SS-Biotin, um Zelloberflächenproteine effizient mit zugänglichen Lysinen zu markieren. Die Lyse-, Erfassungs-, Wasch- und Elutionsbedingungen wurden für eine effiziente Anreicherung und Isolierung optimiert und minimieren gleichzeitig die Kontamination intrazellulärer Proteine.

Das Protokoll wurde für die Verwendung mit verschiedenen Säugetierzelllinien optimiert, einschließlich adhärente und Suspensionszellen, und eignet sich für die Analyse der differenzierenden Expressionsanalyse von behandelten und nicht behandelten Zellen bzw. einer oder mehrerer Zelllinien. Selektivität und Effizienz der Isolierung von Zelloberflächenproteinen wurden durch Western-Blotting und LC-MS-Analyse verifiziert.