Invitrogen™ LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System

Beschreibung

Das LeukoLOCK™ Gesamt-RNA-Isolierungssystem ist eine innovative Methode zur zellulären Fraktionierung von Vollblut und zur Gesamt-RNA-Stabilisierung und -Extraktion aus der Leukozytenpopulation. Das Kit besteht aus einem LeukoLOCK Kit zur Fraktionierung & Stabilisierung (auch separat erhältlich; Kat. Nr. AM1933) und einem LeukoLOCK Gesamt-RNA-Isolierungskit.

Das LeukoLOCK System ist ideal für die Verwendung mit menschlichem Blut geeignet. Blut ist ein Speicher für Zellinformationen; jedoch kann das Vorhandensein von Globin-mRNA in aus Vollblut präparierter RNA die nachgeschalteten Expressionsprofilierungsanwendungen beeinträchtigen. Das LeukoLOCK System nutzt eine filterbasierte Leukozytenabbautechnologie zur Isolierung von Leukozyten aus Vollblut sowie RNAlater™ Lösung zur Stabilisierung der Zellen auf dem Filter. Durch den Ausschluss roter Blutkörperchen wird in der RNA, die aus erfassten Leukozyten gereinigt wird, von Natur aus die Globin-mRNA dezimiert, was die Probennutzbarkeit für Expressionsprofiling und andere Anwendungen verbessert.

Leukozyten-Erfassung und -Stabilisierung
Eine 9–10 ml-Probe mit antikoaguliertem Blut wird durch einen LeukoLOCK-Filter geleitet, der die gesamte Leukozytpopulation erfasst und gleichzeitig rote Blutzellen (einschließlich Retikulozyten), Thrombozyten und Plasma eliminiert. Nach dem Spülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung wird der Filter mit RNAlater Lösung gespült, um die RNA in den abgefangenen Leukozyten zu stabilisieren. Die RNA kann sofort isoliert werden, oder die stabilisierten Zellen können mehrere Tage bei Raumtemperatur oder über längere Zeiträume bei –20 °°C oder –80 °°C gelagert werden.

RNA-Isolierung
Die RNA-Reinigung erfolgt durch den ersten Aufschluss der erfassten Zellen in einer Guanidiniumthiocyanat–-basierten Lösung, die die RNA freisetzt, während gleichzeitig Nukleasen deaktiviert werden. Das Zelllysat wird gesammelt und kurz mit Proteinase K behandelt. Dann wird RNA mit MagMAX Magnetbead-basierter Technologie zum Waschen aus dem Lysat gereinigt, danach mit DNase behandelt (TURBO DNase™) und abschließend gereinigt.

Expressionsstudien
Sowohl quantitative RT-PCR- als auch Mikroarray-Expressionsstudien haben die Eignung der gereinigten RNA für eine zuverlässige Transkriptomprofilierung bestätigt. Im Vergleich zu RNA, die mit einem häufig verwendeten Blut-RNA-Isolierungsverfahren verarbeitet wurde, produziert die mit dem LeukoLOCK System isolierte RNA nach der Amplifikation eine längere mediane aRNA und höhere Prozent-Anwesenheitserläuterungen, ohne dass zusätzliche Schritte nach der Extraktion erforderlich sind, um Globin-mRNA zu entfernen. Da Globin-aRNA 25–40 % des aRNA-Peaks aus der Gesamt-RNA im Vollblut darstellt, ist der Ertrag der Gesamt-RNA verständlicherweise niedriger mit Methoden, die unerwünschte Globin-Transkripte abbauen. Nach der LeukoLOCK-Aufreinigung amplifizierte RNA bietet aufgrund der drastischen Reduktion konkurrierender Globin-Transkripte eine höhere Array-Empfindlichkeit.

Kit-Ausbeute
Die Rückgewinnung variiert von Spender zu Spender, beträgt aber in der Regel 10–20 μg RNA pro 9–10 ml Vollblut. Die mit dem LeukoLOCK System gewonnene RNA enthält weniger als ein Zehntel der Menge an Retikulozyten-abgeleiteten Alpha- und Beta-Globin-mRNAs, die in typischen RNA-Proben aus unfraktioniertem Vollblut enthalten sind.

• Fraktionieren der Leukozyten aus Vollblut in Minuten
• Extrahieren der Gesamt-RNA aus Leukozyten
• Keine zusätzlichen Globin-Reduktionsschritte erforderlich
• Stabilisieren der RNA zur Erhaltung des Expressionsprofils
• Aufbewahren der Leukozyten tagelang bei Raumtemperatur

Nicht mit hohen Durchsatz kompatibel (manuell)

DNA- und RNA-Aufreinigung und -Analyse, RNA-Extraktion, Gesamt-RNA-Isolierung, Gesamt-RNA aus tierischen Zellen und Geweben, Gesamt-RNA aus Blut