Ultrafiltration: Schnelle und effiziente Elution von Proteinen aus Polyacrylamidgelen
Die Ultrafiltration ist eine auf der Membrantrennung basierende Technik, die zur Trennung von gelösten kleinen Molekülen zum Einsatz kommt. Wenn eine Kraft wie eine Zentrifugalkraft auf solche Moleküle angewendet wird, gelangen die Moleküle, die kleiner als die Porengröße der Membran sind, durch die Membran hindurch, während größere Moleküle zurückgehalten werden.
Die Nanosep™ Zentrifugenvorrichtungen wurden für die Anwendung dieser Technik bei der Handhabung von Proteinen und DNA entwickelt. Sie sind mit speziell vorbereiteten Membranen ausgestattet, die unterschiedliche Molekulargewichtsgrenzwerte (MWCO) aufweisen. Die Auswahl der richtigen MWCO (siehe Tabelle 1) ermöglicht die effiziente Konzentration von Proteinlösungen sowie eine schnelle und effektive Durchführung der Entsalzung, des Pufferaustauschs und der Proteinfraktionierung. Diese Vorrichtungen bieten somit eine schnelle und kostengünstige Alternative zu gängigen Methoden für die Elution und Konzentration von Proteinen, die auf Polyacrylamidgelen getrennt wurden. Dank ihrer schonenden Wirkungsweise ist diese Methode besonders für biologisch aktive Moleküle und Zubereitungen von Proteinkomplexen effektiv.
"Die Menge an Polyacrylamidgel-Ausgangsmaterial ist der limitierende Faktor für eine hohe Proteinwiederfindung."
Die Reduzierung der Menge an Polyacrylamid erhöht nicht nur die Ausbeute an eluiertem Protein, sondern reduziert auch signifikant die Elutionszeit – ein wichtiger Faktor bei der Elution von biologisch aktiven Proteinen. Diese Methode wurde sowohl unter nicht denaturierenden als auch unter denaturierenden Bedingungen erfolgreich und ohne signifikante Aktivitätsverluste für die Elution enzymatisch aktiver Proteinmischungen in ihrem nativen Zustand eingesetzt. Der Gehalt an Natriumdodecylsulfat (SDS) im Elutionspuffer kann empirisch bestimmt werden, um die Wiederfindung zu erhöhen und gleichzeitig die biologische Aktivität zu bewahren. Die Ultrafiltration ist daher eine schnelle und schonende Methode, die sich ideal für die Elution biologisch aktiver Proteine eignet (Abbildung 1).
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