Der ELISPOT-Assay
Für die funktionelle Analyse der zellulären Immunologie
Der ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunosorbent spot) ermöglicht unter geeigneten Bedingungen die Visualisierung der sekretorischer einer einzelnen antwortenden Zelle. Somit liefert der ELISPOT-Assay sowohl qualitativ (Art des Immunproteins) als auch quantitativ (Häufigkeit der antwortenden Zellen) Informationen. Aufgrund der unübertroffenen Empfindlichkeit dieses Assays ist die Analyse der Häufigkeit seltener Zellpopulationen (z. B. antigenspezifischer Reaktionen), die zuvor nicht möglich war, jetzt relativ einfach. Da das Design von Multiwell-Mikroplatten, einschließlich der Verwendung von Membranen mit reduzierter Hintergrundfluoreszenz, kürzlich weiterentwickelt wurde, finden ELISPOT-Assays heute breite Anwendung.
Mit Blick auf die Empfindlichkeit des Assays, die Benutzerfreundlichkeit und die Kosten ist die ELISPOT-Plattform für die Entwicklung multifunktionaler T-Zell-Assays für Forschung, Therapie und Diagnostik sicher die beste Wahl.
Optimierung des ELISPOTS
ELISPOT-Assays ermöglichen zwar die Bestimmung der Häufigkeit von sehr seltenen Ereignissen, aber die Interpretation der Daten kann uneindeutig werden, wenn die Anzahl der Flecken in den Antigen-enthaltenden Wells niedrig und die Anzahl der Flecken in den negativen Kontrollwells erhöht ist, insbesondere wenn beides gleichzeitig auftritt. Daher muss die primäre Aufgabe, noch vor dem Einsatz von Statistiken, die Optimierung der grundlegenden Testparameter und Reagenzien sein, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Während die Verwendung hochspezifischer, ELISPOT-validierter AK-Paare der Schlüssel zum Erfolg des Assays ist, sind für eine optimale Leistung eine Reihe weiterer Schritte zu berücksichtigen und durchzuführen.
Die Popularität dieses Assays hat in den letzten Jahren einen Aufschwung erlebt, da Forscher versuchen, ein besseres Verständnis der Immunreaktionen in einer Vielzahl von Anwendungen zu erlangen, einschließlich der Untersuchung des immunologischen Gedächtnisses und der Entwicklung von Impfstoffen.
Auswahl der Platte (Membran)
PVDF-Membranplatten (Merck-Katalognummern MSIPS4W10, MSIPS4510, MAIPSWU10, MAIPS4510) sind einer gemischten Cellulose-Membran (Merck-Katalognummer MSHAS4510) vorzuziehen, da sie eine leicht verbesserte Bindung von Capture-AK und eine bessere Leistung bei der Spot-Detektion bieten, insbesondere bei Fluoreszenzanwendungen. Der einzige Nachteil von PVDF-Platten ist die extreme Hydrophobie des Materials, eine Eigenschaft, die vor Zugabe der Antikörper-Beschichtung eine Vorbenetzung mit Alkohol erforderlich machen kann. Da die gemischte Cellulose-Membran hydrophil ist, können ELISPOTS ohne Vorbenetzung durchgeführt werden.
Negativ-/Positivkontrollen
Für die Messung Ag-spezifischer Reaktionen mittels ELISPOT sind entsprechende Kontrollen entscheidend. Negativkontrollen bestehen in der Regel aus Zellen, die ohne Stimuli kultiviert wurden, während polyklonale T-Zell-Aktivatoren üblicherweise als Positivkontrollen verwendet werden, um sowohl die Funktionalität der Zellen als auch des Assays zu bestätigen. Zu den Positivkontrollen gehören Anti-CD3/CD28-AK, Phytohämagglutinin (PHA) und Concanavalin A (ConA). Diese Aktivatoren induzieren die Sekretion vieler häufiger Zytokine wie IFN-y, IL-2 (Th1), IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 (Th2).
Eine weitere gängige Kontrolle sind die im Handel erhältlichen CEF-Peptidpools (Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus, Influenzavirus). Diese bestehen aus mehreren Epitopen von jedem der drei Viren, für die die meisten gesunden Menschen (~ 90 %) CD8-positive T-Zellen besitzen.
Da wir in diesem Artikel nur einige Aspekte aufführen können, möchten wir auf unser ELISPOT-Whitepaper verweisen, in dem das Assay-Protokoll im Detail besprochen wird, wobei der Schwerpunkt auf den gängigen besten Praktiken und Anleitungen zur Fehlersuche- und -behebung liegt.
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