Thermo Scientific™ T4 DNA Ligase (5 U/μl)

Beschreibung

Katalysiert die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen nebeneinanderliegenden 5‘-Phosphat- und 3‘-Hydroxy-Enden in Doppelstrang-DNA oder -RNA mit der Thermo Scientific™ T4 DNA-Ligase. Das Enzym repariert einsträngige Einbrüche (sog. Nicks) in Duplex-DNA und -RNA oder DNA/RNA-Hybriden. Es verbindet darüber hinaus DNA-Fragmente mit Sticky- oder Blunt-Kettenenden, übt aber auf einsträngige Nukleinsäuren keine Aktivität aus.

Die T4 DNA Ligase erfordert ATP als Kofaktor.

Highlights

• Aktiv in Thermo Scientific Restriktionsenzym, PCR und RT-Puffern (bei Lieferung mit ATP)
• Schnell – Die Sticky-End-Ligation ist innerhalb von 10  Minuten bei Raumtemperatur abgeschlossen.
• Im Lieferumfang enthalten: PEG-Lösung für effiziente Blunt-End-Ligationen

Anwendungen

• Klonen von DNA-Fragmenten, die aus Restriktionsenzymen erzeugt wurden
• Klonen von PCR-Produkten
• Verschmelzen doppelsträngiger Oligonukleotid-Linker bzw. -Adaptoren mit DNA
• Ortsspezifische Mutagenese
• Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP, Verfahren zur Herstellung eines genetischen Fingerabdrucks)
• Ligase-vermittelter RNA-Nachweis (siehe Referenz  3)
• Nick-Reparatur in Duplex-DNA, RNA oder DNA/RNA-Hybriden
• Selbstzirkulation linearer DNA.

Hinweise

• Die Bindung von T4 DNA Ligase an DNA kann zu einer Verschiebung der Bande im Agarosegel führen. Um dies zu vermeiden, die Proben mit 6X DNA-Ladefarbstoff & SDS-Lösung 5 Minuten lang bei 70 °C oder 10 Minuten lang bei 65 °C inkubieren und dann vor der Elektrophorese auf Eis kühlen.
• Bei der Transformation darf das Volumen des Ligationsreaktionsgemischs das Volumen der kompetenten Zellen nicht um mehr als 10 % überschreiten.
• Vor der Elektrotransformation muss die T4 DNA Ligase durch Zentrifugationssäule oder Chloroform-Extraktion aus dem Ligasegemisch entfernt werden. Die extrahierte DNA kann noch weiter mit Ethanol ausgefällt werden.