Multi-Copy Pichia-Expressionskit

Beschreibung

• Das Multi-Copy Pichia-Expressionskit enthält die Vektoren pPIC3.5K, pPIC9K und pAO815 für die Produktion und Auswahl von Pichia-Stämmen, die mehr als eine Kopie des zu untersuchenden Gens enthalten.
• In vielen Fällen hat eine erhöhte Anzahl von Kopien zu erhöhten Expressionswerten geführt.
• Diese Vektoren sind auch separat erhältlich

pPIC9K und pPIC3.5K

• Die Vektoren pPIC9K und pPIC3.5K tragen das Gen für die Kanamycin-Resistenz, das Resistenz gegen Geneticin™ Reagenzien in Pichia verleiht.
• Die spontane Erzeugung mehrerer Insertionsereignisse kann durch Resistenz gegen erhöhte Geneticin™ Reagenzien identifiziert werden.
• Pichia Transformanten werden auf Histidin-mangelndem Medium ausgewählt und auf ihre Resistenz gegen Geneticin™ Reagenzien untersucht.
• Die Fähigkeit, in hohen Konzentrationen von Geneticin™ zu wachsen, deutet darauf hin, dass mehrere Kopien von Kanamycin-Resistenzgenen und Genen von Interesse in das Genom integriert sind.
• Der pPIC9K-Vektor leitet die Sekretion exprimierter Proteine, während die aus pPIC3.5K exprimierten Proteine intrazellulär bleiben.

pAO815

• pAO815 ist ein Pichia-Expressionsvektor, der mehrere Kopien eines Gens in einen einzigen Vektor klonen soll.
• Der Vektor enthält eine Bgl II-Stelle vor dem 5´ AOX1-Gen und eine einzigartige BamH I-Stelle hinter dem 3´ AOX1-Transkriptionsabschlusssignal (TT-Signal).
• Vier Schritte sind erforderlich, um mehrere Kopien des Gens von Interesse zu erzeugen:
  • 1. Das Gen wird in der einzigartigen EcoR I-Stelle im Vektor geklont.
  • 2. Das Konstrukt wird mit BamH I und Bgl II verdaut, um die “Expressionskassette” freizugeben, die den AOX1-Promotor, das Gen von Interesse und 3´ AOX1 TT enthält.
  • 3. Konkatemere der Expressionskassette werden durch Ligation In-vitro erzeugt.
  • 4. Die Mehrfachkopien werden wieder in den pAO815-Vektor eingefügt und in Pichia umgewandelt.