Thermo Scientific™ T4-Polynukleotid-Kinase (10 U/μl)

Beschreibung

T4 Polynukleotide Kinase (T4 PNK) katalysiert die Übertragung des Gammaphosphats von ATP auf die 5'-OH-Gruppe einzel- und doppelsträngiger DNA und RNA, von Oligonukleotiden oder von Nukleosid-3'-Monophosphaten (Vorwärtsreaktion) Die Reaktion ist reversibel. In Anwesenheit von ADP zeigt T4 Polynucleotide Kinase 5'-Phosphatase-Aktivität und katalysiert den Austausch von Phosphatgruppen zwischen 5'-P-oligo-Polynukleotiden und ATP (Austauschreaktion).

Das Enzym ist auch eine 3'-Phosphatase.

• Aktiv in Restriktionsenzym-, RT- und T4 DNA Ligase-Puffern.
• Quelle: E.-coli-Zellen mit einem geklonten pseT-Gen von T4-Bakteriophagen
• Molekulargewicht: Das Enzym ist ein Homotetramer. Es besteht aus vier identischen Proteinuntereinheiten von jeweils 28,9 kDa

• Die Abwesenheit von Endo-, Exodesoxyribonukleasen und Ribonukleasen wurde durch geeignete Qualitätstests bestätigt. Funktionell getestet für die Kennzeichnung von 5 ft-Enden von DNA

• E.-coli-Zellen mit einem geklonten pseT-Gen von T4-Bakteriophagen

• Das Enzym ist ein Homotetramer. Es besteht aus vier identischen Untereinheiten mit je 28,9 kDa

• Eine Einheit des Enzyms überträgt in 30 Minuten bei 37 °C 1 nmol Gamma-Phosphat von ATP auf 5 ft.-OH DNA.
• Die Enzymaktivität wird in folgender Mischung gemessen: 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,5 mM 5 ft.-OH DNA, 0,05 mM ATP und 0,1 MBq/ml [Gamma-³³P]-ATP

• Das Enzym wird geliefert in: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 2 mM DTT und 50 % (v/v) Glycerin
• 10fach-Reaktionspuffer A (für Vorwärtsreaktion): 500 mM Tris-HCl (pH 7,6 bei 25 °C), 100 mM MgCl₂, 50 mM DTT, 1 mM Spermidin
• 10fach-Reaktionspuffer B (für Austauschreaktion): 500 mM Imidazol-HCl (pH 6,4 bei 25 °C), 180 mM MgCl₂, 50 mM DTT, 1 mM Spermidin und 1 mM ADP
• 24 %ige PEG-Lösung: 24 % (w/v) Polyethylenglycol 6000
Hemmung und Inaktivierung:
• Hemmstoffe: Metallchelatoren, Phosphat- und Ammoniumionen, KCl und NaCl in einer Konzentration über 50 mM
• Inaktivierung durch 10-minütiges Erhitzen auf 75 °C oder durch Hinzufügen von EDTA

Empfohlen für:

Markierung von 5 ft-Enden von Nukleinsäuren (3, 4) für Sonden zur Hybridisierung und Transkriptkartierung, Marker für Gelelektrophorese, Primer für die DNA-Sequenzierung, Primer für PCR; 5 ft-Phosphorylation von Oligonukleotiden, PCR-Produkten und anderer DNA oder RNA vor der Ligation; Phosphorylation von PCR-Primern; Erkennung von DNA-Modifikation mit dem [32P]-Postlabeling-Assay (5, 6); Entfernung von 3 ft-Phosphatgruppen (2)

Hinweis:

Polyethylenglykol (PEG) und Spermidin verbessern die Rate und Effizienz der Phosphorylationsreaktion (7). PEG wird in der Austauschreaktionsmischung verwendet. Da T4 Polynucleotide Kinase von Ammoniumionen gehemmt wird, muss zum Ausfällen der DNA vor der Phosphorylation (1, 2) Natriumacetat verwendet werden.