LanthaScreen™ ERK2 A375 Zelllinie

Beschreibung

• Gen-Symbol: ERK2
• Antagonist: Raf-Inhibitor I
• Primärer Agonist: Konstitutiv
• Die Map Kinase (MAPK)-Signaltransduktionskaskade wird durch Wachstumsfaktoren wie EGF, PDGF und HGF aktiviert. Die Bindung dieser Faktoren an ihre jeweiligen Zelloberflächenrezeptoren führt zur Einleitung einer Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Aktivität, die zur sequenziellen Phospho-Aktivierung nachgeschalteter Kinasen wie Ras, Raf, MEK und Erk1⁄2 führt. Aktivierte MEK phosphoryliert Erk2 (MAPK1)-Proteine bei einem spezifischen Thr-Tyr-Motiv (Thr⁄Tyr 185⁄187). Eine Reihe von konstitutiven aktiven Kinasemutationen innerhalb des MAP-Kinase-Signalwegs sind an der Onkogenese beteiligt. Eine dieser Mutationen ist BRAF(V600E), die am häufigsten vorkommende onkogene BRAF-Mutation. Die humane Melanomzelllinie A375 exprimiert BRAF(V600E) endogen, was zur konstitutiven Aktivierung des MAP-Kinase-Signalwegs und zur Phosphorylierung von Erk2 ohne Liganden führt. LanthaScreenTM Erk2-A375 exprimiert GFP-Erk2 konstitutiv unter Kontrolle eines CMV-Promoters. Mit dieser Zelllinie wurde ein homogener Immunassay entwickelt, in dem der Phosphorylationszustand von GFP-Erk2 in Zelllysaten mithilfe eines mit Terbium (Tb) markierten, anti-pTpY-185⁄187-Erk2 Antikörpers in einer zeitaufgelösten FRET (TR-FRET)-Anzeige erkannt wurde. Diese Zelllinie kann zur Bewertung der Verbundaktivität gegen BRAF(V600E) verwendet werden. Das GFP-Erk2-Lentivirus wurde in A375-Zellen transduziert und anschließend mit Blasticidin selektiert. Diese Zelllinie ist eine klonale Population, die durch Durchflusszytometrie mit GFP-Fluoreszenz als Sortiermarker isoliert wird. Diese Zelllinie wurde mit einem lytischen TR-FRET-Immunassay unter optimierten Bedingungen mit EGF als Ligand für die GFP-Erk2-Phosphorylation für EC50 und Z’ validiert. Darüber hinaus wurde dieser Assay unter variablen experimentellen Bedingungen auf Assay-Leistung getestet, einschließlich Zellplattierungsdichte, Stimulationszeit, DMSO-Toleranz und Zelllyse-⁄Äquilibrierzeit. Weitere Informationen über die Verwendung alternativer Reize sowie eines kleinen Molekülinhibitoren werden ebenfalls bereitgestellt.